免疫印迹（Western Blot）检测

WB结果不理想可能的原因自查

从结果倒推操作过程中可能的问题，总的来说，WB结果不理想，可能的问题主要集中在以下几方面部分：

1、阴性结果的原因

1) 二抗条件过低：提高二抗浓度、延长二抗孵育时间或孵育温度

2) 一抗条件过低：提高一抗浓度、延长一抗孵育时间或孵育温度

3) 抗原过少：提高上样量

4) 抗体种属不兼容：需要检测样品的种属来源，一抗与二抗是否相匹配

5) 酶活性：二抗上标记的HRP或AP等酶活性降低，如抗体过期或反复化冻等

6) 封闭过度或封闭剂不兼容：降低封闭剂浓度、缩短封闭时间，或者更换封闭剂种类

7) 底物出现质量问题：可以通过点杂交试验排除底物和酶活性问题

8) 抗体稀释液pH：注意检测pH是否在6-8

9）样品不表达该目的蛋白

10）转膜不足或过头：优化转膜条件

11）其它：PVDF膜、保鲜膜质量问题等

12）抗体质量：建议使用好品牌的抗体。

2、有杂带或背景的原因

1）目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小

2) 样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作

3）二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度

4）上样量过高：降低上样量，减少抗原含量

5）二抗条件过强：降低二抗浓度、缩短二抗孵育时间或改变温度等

6）一抗条件过强：降低一抗浓度、缩短一抗孵育时间和改变温度等

7）抗体质量不佳：如特异性不好，建议购买品牌公司的抗体

8）一抗稀释度不适宜，可以对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度

9）一抗孵育的温度偏高，建议4℃结合过夜

10）抗体浓度过高或洗涤不够，建议降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间

11）膜清洗不全：增加清洗强度，如增加荡洗次数、延长清洗时间等

11）ECL发光液本身因外源污染等原因存在很强的背景光，显影可以显示强的背景光，建议分装A和B液或更换发光液

12）缩短压片或曝光时间

14）电极不平衡或者加样位置偏斜，可以调整电极和加样

15）封闭不全：二抗与抗原有交叉反应，升高封闭剂浓度、延长封闭时间或更换不同的封闭剂，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜

16）封闭物使用不当，比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭；

17）封闭时间不够，一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜

18）抗体非特异性结合，可以降低抗体浓度，减少孵育时间

19）化学显色底物过多，建议按说明书加入适量的显色底物

3、啥条带形状不好看

1）胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀

2）某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致

3) 缓冲液陈旧，成分改变,可以重配

4) 凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走

5）电泳时温度过高，可以降低电流或电压

6）样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀

4、蛋白条带位置（大小）不对

1）胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度

2）抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间

3）酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

4）目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定

5）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量

5、背景有黑色斑点或不均匀的白色斑点和暗背景上白色带

1）抗体与封闭试剂反应，建议使用前过滤封闭试剂

2）HRP含量过高，建议降低酶联二抗的浓度

3）HRP偶联二抗中有聚集体，建议过滤二抗试剂，去除聚集体

4）抗体分布不均匀，建议孵育抗体时使用摇床

6、细胞提取液中没有检测到目的蛋白

1）细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞

2）抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题

3）可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长

4）细胞中的蛋白质被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性

7、目的带很弱，如何加强

1）可以加大抗原上样量，这是最主要的

2）也可以将一抗稀释比例降低

3）还可以延长曝光时间